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稳定同位素——如何玩转质谱内标定量 - MedChemExpress

发布时间：2022/11/29 9:29:26 阅读人数：284

稳定同位素——质谱内标定量的极佳选择

质谱分析具有灵敏度高、样品用量少、分析速度快、分离和鉴定同时进行等优点。随着质谱定量检测技术的广泛发展，稳定同位素类化合物作为内标定量 (Stable Isotope-Labeled Internal Standard，简称 SIL-IS) 目前已被公认为是质谱定量分析领域的极佳选择。因为稳定同位素类化合物与被分析物具有几乎完全相同的分子结构 (图 1)、化学性质、色谱和质谱行为，可以有效地消除电离变化和基质效应^[1]，因而受到越来越多科研人员的推崇，广泛用于临床医学研究及生物医学、环境科学、食品检测等领域。

图 1.未标记的依喜替康甲磺酸盐 (左) 同位素标记的依喜替康甲磺酸盐 d5 (右)

稳定同位素作内标，可以减少基质效应、减少实验的人为误差、提高检测的准确度和精密度、同时检测多个数据、提高实验效率，好处多多。那么稳定同位素作为内标的关键量值指标有哪些，该如何挑选稳定同位素内标呢？干货如下，拿走不谢~

1. 稳定同位素作为内标的关键量值指标

a. 同位素产品纯度：一般 ≥ 98%。常指色谱纯度，如 LCMS/MS，GCMS，HPLC 等，如果产品吸收或者 MS 较弱，也可以用 NMR 检测等。

b. 同位素产品丰度 (Isotopic Enrichment)：一般 ≥ 98%。

c. 同位素产品有效期：同位素化合物内标均在有效期内使用。

2. 如何挑选稳定同位素内标

a. 除非实验特殊需求下，一般不选择有活泼氘 (²H) 取代的同位素产品作内标 (如氨基、羧基、羟基上的氢被氘取代)，这些活泼氘极易被交换为氢。

b. 同位素标记的 ¹³C 和¹⁵N 化合物稳定性较好，但是 ¹³C和¹⁵N 的价格相对较贵些。目前市场上含有氘 (²H) 的同位素产品因为价格相对便宜且数量相对较多，因此在满足实验要求的情况下，也可选择氘代物作为内标。

c. 选择氘 (²H) 代化合物作为内标时，一般选择比非同位素产品分子量多 3 及以上的产品 [即含有氘原子个数为 3 个 (D3) 或者以上]。

稳定同位素的应用

在有机分析研究中，质谱分析法比化学和光学分析法具有更加卓越的性能，而稳定同位素作内标成为了质谱定量的金标准，下面就随着小 M 来看下稳定同位素内标在质谱定量分析中的实际应用吧~

一、糖尿病人视网膜病变治疗研究中的应用

Candesartan 和 Irbesartan 已被证明能有效预防糖尿病视网膜病变造成的损伤。为了开发新型治疗此疾病的滴眼剂配方，Tan A 等人利用 Candesartan-d4 & Irbesartan-d4 稳定同位素做内标，开发了一种新的 LC-MS/MS 方法，此方法可同时定量测定出兔眼组织中 Candesartan & Irbesartan 的含量，并对该方法的浓度范围、准确度及精密度、基质效应、样品回收率等均做了验证。该方法也已成功应用于家兔的体内生物分布和药代动力学研究^[2]。

图 2. Candesartan 和 Candesartan-d4, Irbesartan 和 Irbesartan-d4 的化学结构

图 3. 稳定同位素类化合物做内标实验流程图

那么如何操作呢？实验的具体过程如下：

(1) Candesartan & Irbesartan 标准液及其同位素内标液制备

在乙腈/水 (80/20，V/V) 中配置 Candesartan & Irbesartan 的标准液和内标液，标准液分配成 200 和 500 μg/mL，内标液配置 500 μg/mL 备用，放置于 -20 ℃ 备用。

(2) 样品前处理

称量好的兔眼组织样品在稀释的兔血浆中以 1:19 的比例混合均匀，其匀浆上清液保存于 -80 ℃。取 200 μL 的兔组织匀浆上清液依次与 100 μL 内标液溶于甲醇/水 (20:80，V/V) 和水混合。然后将混合物装载到预处理的 HLB 柱中洗脱。洗脱后的纯品用 200 μL 甲醇/水/甲酸 (70:29.75:0.25，V/V/V) 复溶。

(3) LC-MS/MS 分析样本

将 (2) 中稀释好的的样品 20 μL 注入 C18 柱进行梯度分离，柱温 25 ℃，流速 0.8 mL/min。Candesarta 和 Candesarta-d4 在 5.1 min 洗脱，Irbesartan 和 Irbesartan-d4 在 4.1 min 洗脱。MS 检测采用正电喷雾电离 (ESI) 模式。

(4）数据分析

通过分析六批次 456 个兔组织样本，用 Candesartan-d4 & Irbesartan-d4 做内标，准确测定了兔组织样本中在角膜、房水和玻璃体样本中的精确含量，测定出 Candesartan 在角膜中含量为 1704.75 ng/g，在房水中的含量为 63.45 ng/g；Irbesartan 在角膜中的含量为 3546.30 ng/g，在玻璃体中的含量为 36.52 ng/g.

图 4. Candesartan 在角膜和房水样本中的

LC-MS/MS 色谱图

通过分析六批次 456 个兔组织样本，用 Candesartan-d4 & Irbesartan-d4 作内标，准确测定了兔组织样本中 (角膜、房水和玻璃体) 的精确含量，测定出 Candesartan 在角膜中含量为 1704.75 ng/g，在房水中的含量为 63.45 ng/g。

二、COVID-19 药物治疗研究中的应用

全球 COVID-19 爆发以来，对此疾病的药物治疗研究备受科研工作者的重视。据报道，Ibuprofen 可以有效缓解与 COVID-19 相关的症状。Ibuprofen 的疗效及其不良反应与其在血液中的浓度密切相关，所以准确定量测定 Ibuprofen 在血液中的浓度至关重要。

图 5. Ibuprofen 和 Ibuprofen-d3 的化学结构

Changmao Wang 等人用稳定的同位素标记 Ibuprofen-d3 做内标简单、高效、准确地定量测定人血浆中的 Ibuprofen 含量，该方法不但检测时间短，且无基质效应及个体间差异性的影响，已成功应用于 18 名健康中国志愿者口服 Ibuprofen 颗粒后的临床药代动力学研究，其结果证明了 Ibuprofen 可以改善 COVID-19 免疫反应并缩短患者的康复时间^[3]。

图 6. Ibuprofen 及 Ibuprofen-d3 在血脂、

溶血和人血浆中的基质效应表，

显示 Ibuprofen-d3 作内标基质效应无影响

跟着 M 君已经了解了这些稳定同位素内标在质谱定量分析中的应用，您目前是否也想尝试下稳定同位素产品在实验中的应用呢？下面就让 M 君带您浏览下 MCE 稳定同位素类产品吧！

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参考文献

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1. Ulvik A, Ueland PM, et al. Quantifying Precision Loss in Targeted Metabolomics Based on Mass Spectrometry ａnd Nonmatching Internal Standards. Anal Chem. 2021 Jun 1; 93 (21):7616-7624.

2. Tan A, Fanaras JC, et al. Simultaneous quantification of candesartan ａnd irbesartan in rabbit eye tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 2020 May; 34 (5): e4808.

3. Wang C, Jia Y, et al. Establishment ａnd validation of an SIL-IS LC-MS/MS method for the determination of ibuprofen in human plasma ａnd its pharmacokinetic study. Biomed Chromatogr. 2022 Mar; 36 (3): e5287.