实验操作 | 免疫组化 (IHC) 操作步骤 + 注意事项！| MedChemExpress (MCE)

免疫组织化学 (Immunohistochemistry，IHC)，一种用于检测组织切片中特定抗原或蛋白质的方法。以已知的抗体为探针，与组织或细胞中的特定抗原 (如多肽、蛋白质等) 进行特异性的结合。随后，利用化学反应将这些抗原-抗体复合物进行可视化，从而实现对未知抗原在组织或细胞中的定性、定位甚至定量研究。

图 1. 免疫组织化学 (IHC) 原理图。

IHC 检测可分为直接法 (又称一步法) 和间接法 (二步、三步或多步法)。直接检测方法是直接与偶联物 (例如荧光染料、酶、胶体金或生物素) 结合标记的一抗的一步过程。直接法快速，但对于检测常规处理的组织中的大多数抗原缺乏足够的灵敏度 (图 2)。

图 2. 直接和间接免疫组织化学 (IHC) 方法^[1]。

为了满足灵敏度更高的抗原检测的需求，Coons 等人开发了一种两步法。上一层抗体未标记，而第二层抗体 (针对一抗而产生) 则被标记 (图 2)。

  间接法的灵敏度高于直接法： 

未标记的一抗保留了完全的亲和力，具有更强的抗原结合力，并且每分子一抗的标记物（例如过氧化物酶）数量更多，从而增加了反应强度。

• 间接法可以用较少的一抗检测较少量的抗原，用于放大一抗信号，因为一个一抗至少可以结合两个带标记的二抗。

• 间接法也比直接法更方便，因为相同的二抗可用于检测不同的一抗，前提是后者是在同一物种中产生的。

IHC 实验流程：通常包括样本固定、包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复、灭活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、复染、封片观察 12 个部分。

图 3. 免疫组化（IHC）流程图^[2]。

1

样本固定

目的

1) 充分保存细胞成分，包括可溶性和结构性蛋白质；

2) 防止细胞成分 (包括抗原和酶) 自溶和置换；
3) 稳定细胞材料，避免后续程序产生有害影响；
4) 便于常规染色和免疫染色[1]。

甲醛是常规组织学和免疫组织化学固定剂的标准。甲醛主要保存肽和细胞器的一般结构。

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基本步骤：

1）取材：从动物或人体取得所需的组织样本。对于组织块，要确保其大小适中，不宜过大，以便于固定液能够充分渗透。

2）初步处理：如果组织样本带有血液或其他体液，应先用生理盐水或 PBS 进行冲洗，以去除这些可能影响固定效果的物质。

3）固定：将组织样本放入固定液中。常用的固定液包括 10% 中性缓冲福尔马林 (Formalin，也称为甲醛)、甲醇、乙醇或它们的混合液等。固定液的量通常为组织体积的 10-20 倍，以确保组织能够充分浸入固定液中。大组织标本应切开固定，以免中间部分自溶解腐败。

? 固定时间根据组织类型和实验要求而定，一般固定时间室温 18-24 h。
4）固定后的处理：固定完成后，将组织从固定液中取出，用流水冲洗数分钟，以去除残留的固定液和可能产生的结晶。

   注意事项：

• 固定的时间不宜过长，以免导致组织过度硬化和抗原性的丧失。

• 固定的温度通常为室温或 4°C，避免高温导致组织损伤。

• 在固定过程中，要确保组织样本完全浸入固定液中，避免出现未固定的部分。

• 固定的容器应干净、无杂质，避免对组织造成污染。

2

包埋

目的

保护和支撑组织样本，以便在切片时保持其完整性。通过将组织样本嵌入到固体介质中，可以制作出适合在显微镜下观察的薄切片。

常用的包埋介质包括石蜡、树脂等。石蜡包埋是免疫组化中*常用的方法，因为它可以很好的保存组织形态，提升切片质量。树脂包埋则常用于需要更高分辨率或特殊染色方法的样本。

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基本步骤：

1）脱水：在组织样本固定后，需要将其中的水分去除，以便于包埋介质能够充分渗透。酒精梯度脱水: 75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇、无水乙醇 (I)、无水乙醇 (II) 分别浸泡 1 min。

2）透明：脱水后，组织样本会变得不透明，需要使用透明剂（如二甲苯）来去除其中的酒精和其他溶剂，使组织样本变得透明。通常用二甲苯浸泡两次，每次浸泡 1min。
3）浸蜡：将透明后的组织样本放入熔化的石蜡中，让石蜡充分渗透到组织样本中。这个过程通常需要在温箱中进行，以确保石蜡的均匀渗透。
4）包埋：将浸蜡后的组织样本放入模具中，倒入熔化的石蜡，然后让石蜡冷却凝固。这样，组织样本就被包埋在石蜡中了。

   注意事项：

• 在包埋过程中，要控制好温度和时间，以确保石蜡的均匀渗透和组织的完整性。

• 包埋后的组织块需要冷却凝固后才能进行切片。在冷却过程中，要避免过度冷却导致石蜡碎裂或组织变形。

• 在包埋前，要对组织样本进行充分的固定和脱水处理，以确保其抗原性和完整性。

  
  

3

切片

目的

将包埋后的组织样本切割成薄片，以便于在显微镜下观察和检测。

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基本步骤：

1）切片前的准备：确保包埋后的组织块已经充分冷却并固化。使用适当的切片机进行切片。

2）切片：将包埋好的组织块固定在切片机的样本夹上。调整切片机的切片厚度，通常为 4-5 微米厚，这个厚度是根据需要检测的抗原和实验要求来确定的。

3）展片：使用刷子或毛笔轻轻地将切好的组织切片从刀上取下，并放在温水 (40℃) 中展开。

4）烤片：60℃ 烤片 2 h。

   注意事项：

• 在切片过程中，要控制好切片机的速度和切片刀的锋利度，以获得高质量的切片。

• 切片后，要及时对切片进行处理，以避免抗原的损失和组织的变性。

• 使用适当的黏贴剂，确保切片牢固地附贴在载玻片上，以便于后续的免疫组化实验。

  
  

4

脱蜡水化

目的

将组织切片从石蜡中释放出来，并使其恢复到适合进行后续抗原检测和染色的状态。

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基本步骤：

1）脱蜡：切片首先被置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除切片上的石蜡。通常，这个过程会分为多个步骤，每步大约持续 5 分钟，以确保石蜡被完全去除。例如，可以使用二甲苯 Ⅰ、二甲苯 Ⅱ 和二甲苯 Ⅲ 分别浸泡 5 min。

2）水化：依次置于无水乙醇 I、无水乙醇 II，95% 乙醇、85% 乙醇和 70% 乙醇中，各浸泡 1 次，5 min/ 次；再放入纯化水中清洗浸泡 5 min。

   注意事项：

• 进行脱蜡：脱蜡过程，以确保石蜡被完全去除。否则，残留的石蜡会影响后续的抗原检测和染色。

• 避免干燥：在整个脱蜡水化过程中，应确保切片始终保持在湿润的状态，避免干燥。干燥会导致非特异性抗体结合，从而出现高背景染色。

5

抗原修复

目的

重新暴露或修正这些被封闭或扭曲的抗原，以提高免疫组化实验中的抗体与抗原的结合率，增强信号的强度和特异性[3]。

*常用的修复缓冲液是 10 mM 的 pH 6.0 枸橼酸钠、pH 9.0 的 Tris-EDTA 、pH 8.0 的 EDTA。建议测试多种方法以寻找染色效果*佳的方法。

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抗原修复的方法：

(1) 微波热修复：加入抗原修复液，放入切片，置于微波炉中火 8 min，停火 7 min，转小火 8 min；取出染色盒，冷却至室温。

(2) 水浴热修复: 加入抗原修复液，放入切片，置于水溶锅中加热，其间不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到起作用的温度 (92℃)，维持 40 min 后取出染色盒，冷却至室温。
(3) 高压热修复: 在染色盒中加入抗原修复液，放入切片，置于高压锅内加热至饱压后继续加热 5 min，关闭电源，10 min 后取出染色盒，冷却至室温。

(4) 酶解修复：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K 等。将切片置于含有酶解液的载玻片上，然后在适当的温度和湿度条件下进行酶解 (通常为 37°C，20 min)。酶解后，同样需要冷却切片至室温再进行后续处理。

   注意事项：

• 加热后需自然降温；

• 使用过量的抗原修复液；

• 修复液的不同 pH 值对染色结果的影响比较大；

• 没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原。不同的抗体可能需要不同的抗原修复方法和条件，因此需要根据实验要求和抗体特性选择合适的抗原修复方法。

6

灭活

目的

消除细胞或组织中内源性酶和活性物质的影响，降低背景噪音，提高实验的特异性和敏感性[4]。

(1) 灭活内源性过氧化物酶：HRP 检测系统，常用的去除内源性过氧化物酶的方法是 3% 过氧化氢水溶液，室温 10 min。

(2) 洗涤：用 PBS 或 TBS 等缓冲液洗涤切片、浸泡 2 次，5 min/ 次。

   注意事项：

• H₂O₂ 需现用现配，且 4℃ 避光保存，否则易引起非特异背景。

• H₂O₂ 孵育时间过长也会易引起脱片。

• 部分组织还含有内源性碱性磷酸酶，可用左旋咪唑进行灭活。

  
  

7

封闭

目的

封闭组织切片上非特异性结合位点，防止抗体与这些位点结合，从而减少背景信号。

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基本步骤：

1）非特异位点封闭：将封闭液 (如 5% BSA 或血清等) 滴加到组织切片上，确保封闭液均匀覆盖整个组织区域。然后将切片放入湿盒中，在室温或 37°C 下孵育 30 min，让封闭液与组织切片充分作用。

2）洗涤：封闭结束后，用 PBS 或 TBS 等缓冲液洗涤切片，以去除未结合的封闭液和可能存在的杂质。

8

一抗孵育

免疫组化中的一抗孵育是免疫组化实验的关键步骤。

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基本步骤：

1）选择一抗：根据实验目的选择特异性高、亲和力强的一抗。一抗应该与目标抗原的种属来源、类型等相匹配。

2）稀释一抗：根据一抗的效价和实验要求，用适当的稀释液 (如 PBS、TBS 等) 稀释一抗。
3）涂覆一抗：将稀释好的一抗均匀涂覆在已封闭的组织切片上，确保抗体能够充分接触组织切片上的抗原。
4）孵育：将稀释好的一抗均匀滴加在已封闭的组织切片上，放入湿盒中，室温 (或 37°C) 孵育 1 h，使一抗与抗原充分结合。

   注意事项：

• 确保一抗的质量和特异性，避免使用过期或质量不佳的一抗。

• 充分洗涤组织切片，去除未结合的一抗和其他杂质，减少背景染色。

  
  

9

二抗孵育

二抗的作用是与一抗结合，形成抗原-抗体-抗体复合物，从而增强信号的强度和特异性。

在免疫组化实验中，二抗通常带有标记酶 (如 HRP.AP 等)，这些标记物在后续的显色步骤中可以产生可见的染色信号，便于在显微镜下观察目标抗原在组织中的分布和表达情况。

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二抗孵育的基本步骤：

1) 稀释二抗：参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液或其他适当的溶液稀释二抗。 

2) 孵育二抗：将稀释好的二抗滴加在已经过一抗孵育并洗涤的组织切片上，室温孵育 30 min-60 min。

3) 洗涤：孵育完成后，使用洗涤液 (如 PBST 或 TBST) 在摇床上缓慢摇动洗涤切片，以去除未结合的二抗和其他杂质。洗涤通常需要重复几次，每次洗涤时间一般为 5-10 分钟。??????

   注意事项：

二抗的选择和稀释比例应根据实验的具体要求和一抗的特性来确定。

对于抗体的选择还有疑惑的小伙伴可以翻翻小 M 的往期推文：官宣! MCE 迎来了一位新成员——抗体

10

显色

显色检测中需要考虑的其他因素有酶和显色底物的选择。每种检测酶都有几种不同的显色剂。HRP-DAB 是*常用的显色剂组合。

原理：在免疫组化中通常使用辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP) 等作为标记酶。这些酶能催化底物发生颜色反应，从而在抗原所在的位置形成可见的沉淀物。

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基本步骤：

1）加入酶的底物 (如 HRP 的底物为 DAB，AP 的底物为 BCIP/NBT)。

2）底物在酶的作用下发生化学反应，形成有色沉淀物，通常呈现棕色 (对于HRP-DAB 系统) 或蓝色 (对于 AP-BCIP/NBT 系统)。

3）通过显微镜观察组织切片上的颜色变化，可以确定抗原在细胞或组织中的位置和表达水平。

   注意事项：

• 选择适当的检测系统：根据实验目的和样本特性选择合适的检测系统；

• 优化条件：对一抗、二抗的浓度、孵育时间和温度等条件进行优化，以获得*佳的检测结果。

• 注意防护：DAB 为联苯偶氨化合物，可诱发皮肤癌和膀胱症，在显色操作过程中需注意防护。

11

复染

为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可进行复染[5]。

复染：滴加 80-100 μL 苏木素染色液至完全覆盖组织，室温孵育 5 min，自来水冲洗返蓝。

   注意事项：

• 复染的时间是需要摸索的，这个与苏木精的配制时间有关。

• 如果染色过浅可重复染色，如果染色过深可使用盐酸进行分化。

12

封片观察

在免疫组化实验中，封片观察是结束的步骤，用于保护组织切片、增强对比度和稳定性，并允许在显微镜下进行长时间观察和分析。

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封片步骤：
1）脱水：在完成所有染色步骤后，通常需要将组织切片进行脱水处理，以去除切片上的水分。切片依次使用 70%、85%、95% 乙醇、无水乙醇 I、无水乙醇 Ⅱ 分别浸泡 1 min。

2）透明：脱水后，切片需要进行透明处理，以便封片剂能够均匀分布在切片上。通常使用二甲苯浸泡两次，每次 1 min。

3）封片：将一滴封片剂 (如中性树胶、甘油明胶等) 滴在组织切片上，然后用盖玻片轻轻覆盖。封片剂的选择取决于实验要求和标本类型。封片时要确保没有气泡产生，并且盖玻片与切片之间紧密贴合。

4）干燥：让封片剂自然干燥，或者可以在温箱中加速干燥过程。干燥后的切片可以长时间保存，并随时用于观察。

   注意事项：

• 封好的切片可以长时间保存，但应放置在干燥、避光、温度适宜的环境中，以避免切片受潮、褪色或损坏。

• 封片剂和某些化学试剂可能对人体有害，因此在进行封片操作时要注意安全防护措施，如佩戴手套、眼镜等。

  
  

? Q1：染色弱？
实验过程中，我们常会遇到染色较弱的情况，如下图所示：

图 4. 染色弱。

   可能性原因：
1）抗体浓度过低，孵育时间过短，可提高抗体浓度，延长孵育时间；
2）检查试剂是否超过保质期；
3）检查标本固定方式、抗原修复方式是否适合目标抗原；
4）未沥干切片水份，致使试剂稀释。建议滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液(注意防止切片干燥)；
5）孵育温度过低，若室温低于 15℃，要改放在 37℃ 孵育箱孵育 30-60 min (或 4℃ 冰箱过夜)。

? Q2：产生非特异性染色？

在使用检测进行诊断之前，必须了解反应在细胞或组织内的预期抗原分布。如下图所示，CD79a 抗体仅染色了浆细胞瘤细胞的细胞核。根据目前对该抗原位置(细胞质和细胞质膜) 的了解，该反应被认为不是特异性的。

注：非特异的原因也有是因为修复方式不对，可能是修复太强了。

图 5. 非特异性染色^[6]。

下部插图是异常染色的细节；上部插图描绘了浆细胞瘤中 CD79a 的典型细胞质染色。条 = 60 μm，两个插图条 = 5 μm。

   可能性原因：
1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制；

2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；

3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高 (含血细胞多的组织)，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

4）非特异性组分与抗体结合，需延长封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

5）DAB 孵育时间过长或浓度过高；

6）洗涤不充分，可增加洗涤次数和洗涤时间；

7）染色过程中出现干片。干片容易导致非特异性染色，实验过程中需避免干片。

? Q3：免疫组化染色呈阴性结果的原因？

图 6. 免疫组化阴性染色。  

   可能性原因：
1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误，重新确认抗体信息；

2）确认试剂是否遗漏，添加顺序是否正确；

3）抗原修复条件不合适，摸索*合适抗原修复条件；

4）组织切片本身这种抗原含量低，建议用已知阳性样本作阳性对照。

? Q4：背景强？

图 7. 免疫组化染色背景强。   

   可能性原因：
1）检查一抗和二抗浓度过高，需摸索合适的抗体浓度；

2）是否能去除内源性酶和生物素，可延长内源性酶灭活时间；

3）血清封闭时间是否过短，可延长封闭时间；

4）检查一抗的特异性是否良好，选择特异性高的抗体；

5）适当增加抗体孵育后的洗涤次数和延长洗涤时间。

参考文献：
[1] Ramos-Vara JA,et al. When Tissue Antigens and Antibodies Get Along: Revisiting the Technical Aspects of Immunohistochemistry—The Red, Brown, and Blue Technique. Veterinary Pathology. 2014;51(1):42-87. 

[2] Amereh M,et al.Immunohistochemistry (IHC) staining of in-vitro cancer cell-generated tumoroids. MethodsX. 2023 Jun 3;10:102242. 
[3] Shi SR,et al.Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem. 1991 Jun;39(6):741-8.
[4] Hussaini HM,et al.Immunohistochemistry and Immunofluorescence. Methods Mol Biol. 2023;2588:439-450.
[5] Mebratie DY,et al.Review of immunohistochemistry techniques: Applications, current status, and future perspectives. Semin Diagn Pathol. 2024 May;41(3):154-160.
[6] Ramos-Vara JA, et al. Suggested Guidelines for Immunohistochemical Techniques in Veterinary Diagnostic Laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2008;20(4):393-413.