JNK-IN-8是一种有效的JNK抑制剂，抑制JNK1，JNK2和JNK3，IC50分别为4.7 nM，18.7 nM和1 nM

JNK-IN-8的生物活性

体外

JNK-IN-8抑制c-Jun的磷酸化，c-Jun是JNK激酶的直接底物。JNK-IN-8抑制HeLa和A375细胞中的c-Jun磷酸化，EC50分别为486nM和338nM。JNK-IN-8还具有基于KinomeScan和酶谱分析的出色选择性。这些组合的分析技术累积地表明，JNK-IN-8和JNK-IN-12都是非常具有选择性的共价JNK抑制剂，适用于询问JNK依赖的生物现象[1]。JNK-IN-8是一种选择性泛JNK抑制剂，被发现通过使用KinomeSca方法基于伊马替尼结构的丙烯酰胺激酶抑制剂文库的广碱基激酶选择性分析来抑制JNK激酶。JNK-IN-8具有相对于伊马替尼的1,4-二苯胺和1,3-氨基苯甲酸亚结构的独特区域化学，并使用N，N-二甲基丁烯酸actemide弹头共价靶向Cys154。JNK-IN-8采用L形I型结合构象进入位于ATP结合位点唇缘的Cys 154

JNK-IN-8的实验参考方法

激酶测定

将A375细胞用1μMJNK-IN-8预处理指定的时间量。取出培养基，用PBS洗3次。用1mL裂解缓冲液（1％NP-40,1％CHAPS，25mM Tris，150mM NaCl，磷酸酶抑制剂混合物和蛋白酶抑制剂混合物）重悬细胞沉淀。在4°C下端对端旋转30分钟。通过在Eppendorf中以14000rpm离心15分钟来澄清裂解物。使用Bio-Rad 10DG柱将澄清的裂解物凝胶过滤到激酶缓冲液（0.1％NP-40,20mM HEPES，150mM NaCl，磷酸酶抑制剂混合物，蛋白酶抑制剂混合物）中。凝胶过滤的裂解物的总蛋白质浓度应为约5-15mg/mL。用来自ActivX的探针以5μM标记细胞裂解物1小时。用DTT还原样品，用碘乙酰胺封闭半胱氨酸并凝胶过滤以除去过量的试剂并更换缓冲液。加入1倍体积的2X结合缓冲液（2％Triton-100,1％NP-40,2mM EDTA，2X PBS）和50μL链霉抗生物素蛋白珠浆液，端对端旋转2小时，以7000 rpm离心2分钟分钟。用1X结合缓冲液洗涤3次，用PBS洗涤3次。向珠子中加入30μL1X样品缓冲液，在95°C加热样品10分钟。在110V的SDS-PAGE凝胶上运行样品。转移后，用JNK抗体[1]对膜进行免疫印迹。MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

细胞分析

将JNK-IN-8溶解在DMSO中并储存，然后在使用前用适当的培养基稀释。

稳定表达白细胞介素受体1（HEK293-IL1R）的HEK-293细胞在补充有10％FBS，2mM谷氨酰胺和1x抗真菌/抗生素溶液的Dulbecco＇s Modified Eagle培养基（DMEM）中培养。将细胞在与DMSO或JNK-IN-8温育前血清饥饿18小时，用2μMAnisomycin刺激1小时，并通过在16000g和4℃下离心10分钟澄清裂解物。MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

更新时间：2024/1/2 10:11:10